酶聯(lián)免疫elisa試劑盒吸附試驗(yàn)原理

酶聯(lián)免疫一種酶聯(lián)免疫技術(shù)。用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗體）。即用酶標(biāo)記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，zui后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （以下簡稱ELISA） ：是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用zui廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 （ 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ） 表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。基本原理　　ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測儀進(jìn)行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

用于標(biāo)記的酶

　　用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。目前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用zui廣。

1.辣根過氧化物酶（HRP）

　　過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量zui高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應(yīng)的zui適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的zui大吸收光譜分別為275nm和403nm。

　　酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

　　純酶的RZ多在3.0以上，zui高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應(yīng)時(shí)的供氫體有幾種：⑴鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，zui大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變,是目前國內(nèi)ELISA中zui常用的一種；⑵聯(lián)大茴香胺（OD），產(chǎn)物為橘黃色，zui大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；⑶5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，zui大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；⑷鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，zui大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯。

2.堿性磷酸酶

　　系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，zui大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。

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